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                      RNA原位檢測在骨和軟骨樣本制備處理技術淺談及應用

                      發布時間:2020-12-25

                      瀏覽次數:386

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                      作為新一代RNA原位檢測技術,RNAscope為**的ACD檢測產品為在FFPE、冰凍切片中檢測各種RNA,包括mRNA、lncRNA、點突變、外顯子跳躍等提供了高效的解決方案。由于采用了有別于傳統RNA原位雜交技術的專利的探針設計,以及信號級聯放大系統,ACD的RNAscope, Basescope, miRNAscope技術克服了由于RNA易遭受環境中隨處存在的RNase降解導致的高信噪比,低敏感度的困難,從而解決了RNA原位檢測的**問題。

                      隨著該項技術在國內的**推廣,干細胞和發育領域,**及相關領域,傳染病微生物研究領域等都在使用該項技術進行對應的研究。然而,骨及軟骨樣本由于其本身的特殊性,在國內進行RNA原位檢測的應用相對較少??v觀國外相關文獻,使用RNAscope技術在骨骼或軟骨樣本中進行RNA原位研究還是很常見。例如在發育類的研究中,2017年發表在J Clin Invest上的文章中[1],有學者使用RNAscope 技術研究了Rnf146條件性敲除前后顱骨和牙齒發育過程中,Noggin和Shh mRNA的分布情況(見下圖,箭頭所指棕色信號點為RNAscope在顱骨和牙齒中檢測到的RNA信號)。


                      那么對于骨和軟骨樣本要做如何處理,才能夠適用于RNA原位檢測呢?以下是結合近期國內客戶的部分結果,分享給大家的一些樣本處理上的小貼士。


                      1. 骨和軟骨樣本固定:

                      對于骨和軟骨樣本,及時充分的固定是進行RNA原位檢測的關鍵步驟。骨樣本或者軟骨樣本取下后,**時間進行充分固定,可以很好的保護樣本內的RNA。固定充分時RNA和蛋白很好的交聯在一起,可以防止被過度降解。一般對于骨和軟骨樣本,建議使用中性福爾馬林固定液(10%,NBF)在約20 倍骨體積下固定24-48小時。

                      2. 骨和軟骨樣本脫鈣:

                      由于骨和軟骨樣本本身存在鈣成分,故脫鈣是進行后期蠟塊制備,切片的必要步驟。為了適用于RNA原位檢測,選取合適的脫鈣液十分重要。ACD公司的脫鈣液以及國內某公司的一款快速脫鈣液(Preserve脫鈣液)已經被證實可以在很好的脫鈣的同時保存骨樣本內的RNA,以達到后期RNA原位檢測的目的。兩種脫鈣液的區別在于前者溫和但耗時較長(數周);后者脫鈣效力較強,時間較短(通常24小時內)。兩種脫鈣后的骨和軟骨經驗證RNA都能得到很好的保存。

                      脫鈣時同樣需要使用20倍組織體積的脫鈣液,根據說明書推薦時間進行孵育。脫鈣是否完全以使用鑷子可以彎曲樣本為標準。

                      注意:市面上的脫鈣液種類較多,目前經客戶反饋的一些其他種類的脫鈣液使用后RNA保存效果不佳,故選擇脫鈣液時要謹慎。

                      3. 脫鈣后步驟:

                      脫鈣結束后要使用清水徹底沖洗樣本約10分鐘。之后如果制備石蠟塊,則樣本可以直接進入酒精脫水步驟。

                      如果制備冰凍樣本,建議樣本放入PBS浸泡1-2小時,之后放入4攝氏度的15%和30%蔗糖溶液直至樣本沉入底部(該步操作可以有效保護組織形態)。之后取出樣本用吸水紙蘸干外部水分后OCT包埋。

                      4. 結果例圖

                      下圖為國內客戶提供的骨(左圖)和軟骨(右圖)RNAscope檢測結果例圖。圖中紅色信號點為使用RNAscope 2.5 HD Red檢測試劑盒檢測的小鼠骨或軟骨組織內Mm-Ppib的RNA信號(福爾馬林固定24小時,Preserve脫鈣液22小時處理的石蠟切片)。

                      RNAscope技術是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發的RNA原位雜交產品,在近年來的生物檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比,RNAscope技術屬于新一代RNA原位雜交技術,其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長鏈RNA探針的弊端,配以自身級聯放大檢測原理,可以高效敏感地檢測到目標RNA。該方法的具體優勢如下:

                      01

                      應用**

                      使用RNAscope技術,靶點RNA為大于等于300個堿基的特異序列,即可進行探針設計。因而RNAscope技術可以應用于幾乎所有物種,所有組織以及所有基因的檢測。

                      02

                      特異性強

                      RNAscope獨特的雙Z(ZZ) 探針設計有效的防止了探針的非特異性結合,同時降低了背景干擾。由于結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會產生完整的信號放大分子結合位點,并會在雜交過程中被洗脫掉,從而防止非特異性信號的放大,使得探針的信號具有高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可完成。

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                      靈敏度高

                      RNAscope方法檢測每個RNA 分子時,只需三對雙Z(ZZ)探針即可完成雜交和信號的可視化。

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                      單分子可視化和單細胞定量:

                      使用RNAscope技術雜交上三對及以上雙Z 探針即可在標準的顯微鏡下呈現可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細胞內RNA 的表達水平。

                      05

                      兼容降解的RNA

                      由于RNAscope三對雙Z探針即可檢測到目標RNA,而通常針對靶點RNA設計的探針為20對雙Z 探針,因而即使目標RNA發生部分降解,仍可以穩定有效地檢測到靶點RNA。

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                      檢測結果穩定一致性

                      RNAscope技術用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業化合成,且該技術針對不同樣本類型(冰凍切片, 石蠟切片,懸浮細胞,貼壁細胞等)已經有成熟的實驗操作流程,故使得RNAscope技術檢測結果具有穩定性和一致性。除了可以在實驗室進行手工操作外,該產品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動平臺上運行,為結果的一致性和穩定性提供了可靠的依據。

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                      多通道多靶點同時檢測

                      由于RNAscope技術可以同時進行多通道探針雜交以及信號放大,故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點;而在熒光檢測過程中,可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。


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