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                      RNAscope在**領域的應用 | Nature Cell Science發表文章舉例之一

                      發布時間:2020-12-03

                      瀏覽次數:299

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                      對于**及**免疫的研究,近年來出現一些對于特異性抗體應用的挑戰,像GPCR、點突變以及高度同源序列翻譯產物的檢測都因無法生成有效抗體從而無法在蛋白水平進行原位檢測;與此同時對于轉錄水平的外顯子跳躍,以及分泌型蛋白的檢測由于抗體檢測無法實現,或者分泌蛋白一旦合成則離開原始分泌細胞導致檢出失真,導致需要在常規的DNA FISH以及蛋白免疫組化(IHC)方法外,采用RNA原位檢測定位,從而對RNA的空間定位進行分析,以達到不同的科研檢測目的。本文為使用近年來出現的新一代RNA原位檢測技術——RNAscope及Basescope技術,在**領域進行原位追蹤發表在Nature, Cell, Science文章的舉例叢文。本期將聚焦2018年發表的2篇該類文章,了解國際大咖如何在**領域研究中,使用到該技術,并解決哪些問題。


                      文章舉例一

                      2018年Biehs課題組在Nature上發表了基底細胞*(BCC)存活機制的研究[1],并指出Hh和Wnt途徑的靶向**可能是防止殘留BCC的有效方法。Erivedge(vismodegib)是一種批準用于基底細胞*(BCC)的**藥物。盡管vismodegib具有很強的抗**活性,但**后仍殘留有**細胞。研究人員發現這些殘留的**并非發生了基因突變而產生耐藥,而是通過Wnt通路重新編程驅動重要轉錄因子表達的增強子,從而使得BCC細胞存活。因此,Biehs等人認為Hh和Wnt途徑的靶向**可能是防止殘留BCC的有效方法。
                      盡管Hedgehog通路**劑在**BCC中有效,但某些患者中殘留疾病仍然存在,并且在中斷**后有可能促進復發。在文章中,為了研究**劑vismodegib對****的作用,Biehs等人使用了Btc3的Ptch1-Trp53小鼠模型,發現用vismodegib**的小鼠具有殘留的BCC**,這些**會在停止**后快速再生。此時殘留的BCC會啟動類似小泡間表皮和峽部干細胞的轉錄程序。這一過程伴隨著快速的Wnt途徑活化和超級增強子的重新編程,以驅動關鍵轉錄因子的活化。因此,用vismodegib和Wnt途徑**劑**BCC可以有效減少殘余的**細胞存活。
                      在vismodegib**后,由于缺乏有效抗體,Biehs等人使用了RNAscope ISH對**中BCC細胞進行甄別。

                      vismodegib處理的BCC從膨大細胞(RNAscope檢測到的Lhx2 mRNA,上圖c和f,紅色信號點)向小泡間表皮/峽部細胞轉化(RNAscope檢測到的DefB6 mRNA,上圖j和k,紅色信號點)。

                      由于BCC形成過程中需要Wnt信號,故Biehs等人使用RNAscope ISH分析Axin2表達水平與Wif1(Wnt信號的有效分泌**劑)表達水平的關系。結果顯示Axin2表達水平與Wif1水平成反比,提示vismodegib與Wnt**劑聯合使用可降低殘留BCC**的發生率。**Biehs等人用Hh**劑(vismodegib)聯合Wnt**劑(抗LRP6)**BCC**可減少Wnt信號傳導并減少殘留**。


                      文章舉例二

                      2018年Apicella等人在Cell Metab上發表了一篇文章[2],針對*細胞乳酸分泌增加,可維持MET和EGFR靶向療法的非細胞自主適應性耐藥進行研究。**基質在維持耐藥性中具有重要作用,基質分泌的生長因子HGF(肝細胞生長因子)可以在*細胞中**MET受體信號通路。MET**可以補償由于**靶向藥物**時引發的**細胞其他(例如EGFR)信號**。但是人們對于*細胞是否以及如何指示其微環境**HGF分泌,并介導耐藥性了解甚少。Apicella等人研究發現,在長期使用酪氨酸激酶**劑(TKIs)的**下,EGFR或MET依賴的*細胞出現糖酵解和乳酸生成增加的代謝轉變。進一步研究證實分泌的乳酸是指導**相關的成纖維細胞以核因子kB依賴性方式產生肝細胞生長因子(HGF)的關鍵分子。HGF增加,作用于其靶向受體MET,***細胞信號傳導,持續抵抗TKIs。涉及乳酸分泌途徑的靶向**藥物可以消除EGFR耐藥性,證明了該代謝產物在適應性過程中的關鍵作用。
                      Apicella等人用特異的抗MET TKI化合物(JNJ-605)**帶有EBC1(MET依賴的NSCLC細胞系)異種移植瘤的小鼠,直至產生耐藥性。(稱為“RES-J”**)
                      并通過RNAscope ISH證實了適應性耐藥細胞和**中基質Hgf表達的增加(由于HGF屬于分泌型因子,蛋白水平很難在原位定位分泌該蛋白的細胞類型。而RNAscope由于檢測的是HGF的mRNA,可以明確檢測到該分泌蛋白的所在原始細胞)。在對乳酸/ HGF軸的**是否增強了對TKI的臨床抵抗力的研究中,Apicella等人選取了6例基礎性和耐藥性的EGFR TKIs的NSCLC患者,從中獲得配對的FFPE**樣本,通過RNAscope ISH-IHC共染,證實6例患者樣本中有3例間質HGF表達增加。


                      RNAscope技術是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發的RNA原位雜交產品,在近年來的生物檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比,RNAscope技術屬于新一代RNA原位雜交技術,其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長鏈RNA探針的弊端,配以自身級聯放大檢測原理,可以高效敏感地檢測到目標RNA。該方法的具體優勢如下:

                      應用** 

                      使用RNAscope技術,靶點RNA為大于等于300個堿基的特異序列,即可進行探針設計。因而RNAscope技術可以應用于幾乎所有物種,所有組織以及所有基因的檢測。

                      特異性強

                      RNAscope獨特的雙Z(ZZ) 探針設計有效的防止了探針的非特異性結合,同時降低了背景干擾。由于結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會產生完整的信號放大分子結合位點,并會在雜交過程中被洗脫掉,從而防止非特異性信號的放大,使得探針的信號具有高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可完成。

                      靈敏度高

                      RNAscope方法檢測每個RNA 分子時,只需三對雙Z(ZZ)探針即可完成雜交和信號的可視化。

                      單分子可視化和單細胞定量

                      使用RNAscope技術雜交上三對及以上雙Z 探針即可在標準的顯微鏡下呈現可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細胞內RNA 的表達水平。

                      兼容降解的RNA

                      由于RNAscope三對雙Z探針即可檢測到目標RNA,而通常針對靶點RNA設計的探針為20對雙Z 探針,因而即使目標RNA發生部分降解,仍可以穩定有效地檢測到靶點RNA。

                      檢測結果穩定一致性

                      RNAscope技術用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業化合成,且該技術針對不同樣本類型(冰凍切片, 石蠟切片,懸浮細胞,貼壁細胞等)已經有成熟的實驗操作流程,故使得RNAscope技術檢測結果具有穩定性和一致性。除了可以在實驗室進行手工操作外,該產品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動平臺上運行,為結果的一致性和穩定性提供了可靠的依據。

                      多通道多靶點同時檢測

                      由于RNAscope技術可以同時進行多通道探針雜交以及信號放大,故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點;而在熒光檢測過程中,可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。



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